Wat is een recombinant plasmide?
Een plasmide is een cirkelvormig stuk DNA dat in veel bacteriën wordt gevonden.Het meest opvallende kenmerk van plasmiden is dat ze onafhankelijk van het belangrijkste DNA van de gastheer repliceren.Vaak wordt een plasmide gebruikt in recombinante kloneringstechnologie om nieuw geïsoleerde genen te klonen.Het is ook heel gebruikelijk om een recombinant plasmide te gebruiken om grote hoeveelheden van een bekend gen tot expressie te brengen om RNA of eiwit ervan te verkrijgen.Een dergelijke recombinante genexpressie is onmisbaar voor de biotechnologie -industrie.
Recombinante plasmiden werden voor het eerst ontwikkeld in de laboratoriumrat van de bacteriewereld, Escherichia coli .Veel andere soorten bacteriën kunnen dergelijke plasmiden herbergen.Deze stukjes zelfreplicerend DNA kunnen op natuurlijke wijze overbrengen tussen verschillende soorten bacteriën.Desondanks was het soms moeilijk om de recombinante plasmiden in andere soorten bacteriën te introduceren.
De primaire procedure voor het introduceren van DNA in andere cellen staat bekend als transformatie, waarbij de bacteriën worden behandeld met chemicaliën waardoor ze meer kans maken om buitenlands DNA op te nemen.Een andere techniek omvat het schokken van de bacteriën met een elektrische stroom.Dit staat bekend als elektroporatie.
Redenen voor het creëren van een recombinant plasmide variëren.Vaak wanneer DNA voor het eerst wordt geïsoleerd uit een bepaald weefsel of organisme, wordt het omgezet in plasmiden om een bibliotheek te creëren.Dan kan DNA worden geëxtraheerd uit individuele kolonies.Vervolgens kunnen ze worden gescreend door DNA -sequencing om te bepalen welke soorten genen aanwezig zijn, als de sequenties aanwezig zijn in een database.Soms worden genen met onbekende functies gekloond.
In andere gevallen is het genproduct bekend, maar de onderzoekers willen er grote hoeveelheden van uitdrukken voor verder onderzoek.Het gen kan worden gekloond in recombinante plasmiden die overexpressievectoren zijn.Ze zijn speciaal ontworpen om grote hoeveelheden RNA of eiwitten te produceren.Dit is bijzonder waardevol geweest voor recombinante menselijke eiwitten, die voorheen vaak alleen verkrijgbaar waren bij kadavers, waardoor het erg moeilijk was om de functie van een bepaald gen te bestuderen.
Verschillende factoren zijn betrokken bij het construeren van een plasmide dat kan worden gebruikt bij moleculaire klonering.Het plasmide moet een selecteerbare marker hebben.Dit maakt het mogelijk om een cel met het gen te selecteren.Normaal gesproken verwijdert de populatie cellen die het gen ontbreekt met de marker de hoeveelheid cellen die het dragen sterk uit.Over het algemeen heeft een recombinant plasmide resistentie tegen een antibioticum, of kan groeien in afwezigheid van een bepaald aminozuur.
Een dergelijk plasmide heeft een oorsprong van replicatie nodig, zodat het kan beginnen met het synthetiseren van zijn recombinante DNA.Bovendien vereist een recombinant plasmide een reeks speciale sequenties om een restrictie -enzym het DNA te splitsen om een gen in de kloneringsvector te laten worden geplaatst.Er zijn een groot aantal restrictie -enzymen die zeer gespecialiseerd zijn voor specifieke DNA -sequenties die aanwezig moeten zijn waar het gen begint en eindigt.
Traditionele bacteriestammen worden al tientallen jaren gebruikt voor het klonen van DNA.Bovendien zijn er nieuwe kits die speciaal geconstrueerde bacteriestammen gebruiken om overexpressie van het genproduct te vergemakkelijken.Ze combineren de technologie voor het klonen van een gen met een methode die een eenvoudige zuivering van het eiwit uit het gen mogelijk maakt zodra het in het recombinante plasmide is gekloneerd.